چکیده
فروپتوز به عنوان یک هدف عملی برای از بین بردن سرطانهای مقاوم به درمان و متاستاتیک مطرح شده است۱. با این حال، هنوز مشخص نیست که کدام سیستمهای نظارتی فروپتوز میتوانند یک پنجره درمانی برای بهرهبرداری از ناسازگاری ردوکس در سرطان فراهم کنند. در ملانوما، گلوتاتیون پراکسیداز ۴ (GPX4) مانع از فروپتوز در طول متاستاز خونی میشود، اما در متاستاز لنفاوی غیرضروری است۲. در اینجا، با استفاده از یک مدل ملانومای متاستاتیک موش که برای متاستاز به غدد لنفاوی انتخاب شده است، نشان میدهیم که سلولهای متاستاتیک مشتق از غدد لنفاوی، در مقایسه با همتایان اولیه خود، کاهش چشمگیری در بیان گلوتامات-سیستئین لیگاز (GCLC) و سطوح پایینتری از گلوتاتیون احیا شده (GSH) از خود نشان میدهند. این تغییر متابولیک در نیچ هیپوکسیک لنفاوی رخ میدهد. در شرایط مشابه کمبود اکسیژن، GPX4 دچار یوبیکوئیتیناسیون و تخریب پروتئازومی میشود. در پاسخ، سلولهای متاستاتیک غدد لنفاوی وابستگی بیشتری به پروتئین سرکوبگر فروپتوز ۱ (FSP1) پیدا میکنند که در نزدیکی لیزوزومهای اطراف هسته قرار دارد. این یافتهها نشان میدهند که کاهش وابستگی به محور GPX4، سلولهای ملانوما را قادر میسازد تا به سمت وابستگی به FSP1 متمایل شوند. قابل توجه است که تکدرمانی داخل توموری با مهارکنندههای انتخابی FSP1 (viFSP1 و FSEN1) به طور مؤثری رشد ملانوما را در غدد لنفاوی سرکوب میکند، اما در تومورهای زیرجلدی تأثیری ندارد؛ این موضوع بر وابستگی خاص ریزمحیط به FSP1 تأکید دارد. بنابراین، هدف قرار دادن FSP1 در غدد لنفاوی پتانسیل بالایی برای جلوگیری از پیشرفت ملانوما دارد.
مقدمه
اکسیداسیون کنترلنشده لیپیدها که وابسته به آهن است، باعث فروپتوز میشود—یک نوع مرگ سلولی غیرآپوپتوزی با پیامدهای گسترده برای بیماریهای انسانی، از جمله تخریب عصبی، آسیب ایسکمی-خونرسانی مجدد و سرطان۳،۴. GPX4 نگهبان فروپتوز است و از GSH برای سمزدایی و کاهش اکسیداسیون لیپیدها استفاده میکند۵،۶. بنابراین، کاهش سیستئین سلولی یا مهار GPX4، در کنار فرآیندهای دیگر، میتواند منجر به تجمع کشنده لیپیدهای اکسید شده، عمدتاً بر روی فسفولیپیدهای حاوی اسیدهای چرب غیراشباع، و در نهایت پارگی غشای پلاسما شود۷.
القاء فروپتوز به عنوان یک استراتژی احتمالی برای هدف قرار دادن سرطانهای مقاوم به درمان و متاستاتیک مطرح شده است۸. با این وجود، سلولهای سرطانی به طرز ماهرانهای از سازگاریهای اکسایشی-کاهشی مؤثر برای کاهش اکسیداسیون کنترلنشده لیپیدها بهره میبرند، از جمله مسیر FSP1-یوبیکینون و موارد دیگر۹،۱۰،۱۱،۱۲. در زمینه متاستاز سرطان به غدد لنفاوی (LN)، سلولهای ملانوما به طور موقت با گنجاندن مقادیر بالای اسید اولئیک در غشای فسفولیپیدی خود از فروپتوز محافظت میشوند۲. جالب توجه است که در حالی که سلولهای ملانومای متاستاتیک در خون به GPX4 وابسته هستند و دچار مرگ ناشی از استرس اکسیداتیو میشوند۲،۱۳،۱۴، سلولهای ملانومای متاستاتیک در لنف مستقل از GPX4 هستند اما همچنان در برابر فروپتوز محافظت میشوند۲.
مقایسه زمینههای ریزمحیطی متمایز که در آن سلولهای سرطانی حساسیت یا وابستگی متفاوتی به GPX4 نشان میدهند، راهی برای روشن کردن مکانیسمهای پیچیده و هنوز کمتر شناختهشده حاکم بر آسیبپذیری و مقاومت در برابر فروپتوز فراهم میکند. برای بررسی این موضوع، ما از یک مدل موشی درونتنی متاستاز ملانوما که برای متاستاز به غدد لنفاوی انتخاب شده بود، در مقایسه با ردههای زیرجلدی (s.c.؛ تومور اولیه) استفاده کردیم۱۵. این مدل مکانیسمی از تنظیم وابسته به زمینه مقاومت به فروپتوز را که توسط ریزمحیط غدد لنفاوی واسطهگری میشود، آشکار کرد و فرصتهای درمانی بالقوهای را برای مهار رشد تومور در غدد لنفاوی برجسته ساخت.
استقرار در غدد لنفاوی، دفاع در برابر فروپتوز را تغییر میدهد
برای بررسی چگونگی تأثیر استقرار در غدد لنفاوی بر وابستگیهای نظارتی فروپتوز در ملانوما، ما از یک مدل موشی درونتنی متاستاز ملانوما استفاده کردیم که با انتخاب متاستازهای غدد لنفاوی در طول نه نسل و با استفاده از استراتژی اقتباسشده از دیگر مدلهای متاستاز به اندامهای خاص ایجاد شده بود۱۵. به موشهای C57BL/6J، رده سلولی ملانومای سینژنیک B16-F0، که از این پس رده اولیه نامیده میشود، به صورت زیرجلدی تزریق شد. متاستازهای خودبهخودی غدد لنفاوی جدا، در محیط آزمایشگاهی تکثیر و مجدداً به موشهای سالم در طی نه نسل تزریق شدند، که منجر به تولید نزدیک به ۳۰۰ رده متاستاتیک منحصر به فرد غدد لنفاوی شد۱۵ (شکل 1a). تحلیل میزان وقوع متاستاز در ۳۰ رده سلولی در نسلهای مختلف نشان داد که ردههای متاستاتیک غدد لنفاوی نسلهای آخر (LN7، LN8 و LN9، از نسلهای ۷ تا ۹) در مقایسه با ردههای اولیه، میزان بالاتری از متاستازهای خودبهخودی غدد لنفاوی را نشان میدهند۱۵.
a، طرح شماتیک تولید ردههای ملانومای متاستاتیک به غدد لنفاوی از طریق انتخاب سریالی درونتنی در طول نه نسل. این نمودار با استفاده از BioRender ایجاد شده است. b،c، سطوح رونویسی Gclc (b) و Fsp1 (c) در نسلهای مختلف غدد لنفاوی. TPM، رونوشت در هر میلیون. d، ایمونوبلات ACSL3، ACSL4، GCLC، FSP1، xCT و GPX4 در ردههای B16-F0 (اولیه)، نسلهای اولیه (LN1) و نسلهای آخر (LN7-9) متاستاتیک به غدد لنفاوی. e–l، کمیسازیهای فردی (e،g،i،k) و گروهی (f،h،j،l) سطوح بیان پروتئین GCLC (e،f)، FSP1 (g،h)، GPX4 (i،j) و ACSL4 (k،l) در نسلهای مختلف غدد لنفاوی. هر تکرار نشاندهنده یک آزمایش مستقل است. برای e–l، دادهها به صورت میانگین ± انحراف معیار نشان داده شدهاند. تحلیل آماری با استفاده از آنالیز واریانس یکطرفه (ANOVA) و به دنبال آن آزمون Dunnett (e،g،i و k) و آزمون تی-استیودنت دوطرفه غیرجفتی با تصحیح Welch (f، h، j و l) انجام شد.
برای درک چگونگی تغییر تمایل سلولهای ملانوما به مرگ سلولی در اثر استقرار در غدد لنفاوی، ما تحلیلهای توالییابی RNA (RNA-seq) را روی ردههای متاستاتیک اولیه و نسلهای آخر غدد لنفاوی انجام دادیم (شکل تکمیلی 1a). تحلیل مقایسهای بیان رونوشت ژنهای کلیدی مرگ سلولی بین نسلهای آخر (LN7-9) و نسلهای اولیه (اولیه، LN1 و LN2) ردههای متاستاتیک غدد لنفاوی، تفاوتهایی را در ژنهای مرتبط با فروپتوز، نکروپتوز، اتوفاژی و آپوپتوز نشان داد. قابل توجه است که ژنی که بیشترین کاهش بیان را در میان تمام این مسیرهای مرگ سلولی داشت، Gclc بود (شکل تکمیلی 1b)، که برای سنتز GSH از نو ضروری است و میتواند با پر کردن مجدد GSH، که یک کوفاکتور برای GPX4 است، به محافظت در برابر فروپتوز کمک کند۱۶،۱۷. در مقابل، Fsp1 (همچنین با نام Aifm2 شناخته میشود) در میان ژنهای مرتبط با فروپتوز در ردههای متاستاتیک نسلهای آخر غدد لنفاوی افزایش بیان داشت (شکل تکمیلی 1b).
تحلیل بیان ژن کاهش تدریجی Gclc (شکل 1b) و افزایش تدریجی Fsp1 را در طول نسلهای ردههای غدد لنفاوی (شکل 1c) نشان داد، که این موضوع توسط تحلیل PCR کمی (qPCR) نیز تأیید شد (شکل تکمیلی 1c). سطوح پروتئین نیز مقادیر پایینتری از GCLC و مقادیر بالاتری از FSP1 را در نسلهای آخر در مقایسه با رده اولیه (B16-F0) و نسل اول (LN1-18IL) نشان داد (شکل 1d-h). این تغییرات همبسته نشان میدهند که پاساژ سریالی از طریق غدد لنفاوی باعث کاهش بیان Gclc و افزایش بیان Fsp1 میشود. هیچ تفاوت معناداری در سطوح mRNA ژنهای Gpx4، Acsl4، Acsl3 یا Slc7a11 (ژنی که زیرواحد عملکردی سیستم \({{\rm{x}}}_{{\rm{c}}}^{-}\) یا xCT را کد میکند) مشاهده نشد (شکل تکمیلی 1d-h). با این حال، سطوح پروتئین GPX4 و ACSL4 به طور معناداری کاهش یافته بود، به همراه کاهشهای جزئی در ACSL3 و سیستم \({{\rm{x}}}_{{\rm{c}}}^{-}\)، در ردههای نسل آخر در مقایسه با ردههای اولیه (شکل 1d,i-l و شکل تکمیلی 1i,j).
در ادامه، برای ارزیابی نقش محیط غدد لنفاوی در تنظیم FSP1، GCLC و GPX4، سلولهای B16-F10 نوع وحشی (WT) به صورت زیرجلدی (s.c.) یا داخل غده لنفاوی (i.n.) به موشهای C57BL/6J تزریق شدند. محیط غدد لنفاوی با دسترسی کم به اکسیژن مشخص میشود، با غلظت اکسیژنی که تقریباً بین ۱ تا ۳ درصد متغیر است و به طور موقت تا ۰.۵ درصد نیز کاهش مییابد۱۸. بر این اساس، ما از HIF-1α به عنوان نشانگری برای ارزیابی هیپوکسی تومور استفاده کردیم و دریافتیم که تومورهای داخل غده لنفاوی سطوح بالاتری از HIF-1α را در مقایسه با تومورهای زیرجلدی نشان میدهند، که با دسترسی کمتر به اکسیژن در محیط غدد لنفاوی مطابقت دارد (شکل تکمیلی 1k-m). مطابق با ردههای متاستاتیک غدد لنفاوی، تومورهای داخل غده لنفاوی سطوح پروتئین GCLC و GPX4 کمتری را در مقایسه با تومورهای زیرجلدی نشان دادند (شکل تکمیلی 1k,m-o)، به همراه یک روند غیرمعنادار به سمت افزایش بیان FSP1 در سلولهای نوع وحشی (شکل تکمیلی 1k,p). کاهش مشابهی در GCLC و GPX4 در ردههای B16-F10 با حذفی ژن (KO) Fsp1 که به صورت داخل غده لنفاوی تزریق شده بودند، مشاهده شد (شکل تکمیلی 1l). قابل ذکر است که هم سلولهای B16-F10 نوع وحشی و هم Fsp1-KO با ۱۰۰٪ بروز تومور تشکیل دادند. این یافتهها نشان میدهند که ریزمحیط غدد لنفاوی به طور مستقل از FSP1 باعث کاهش GCLC و GPX4 میشود.
FSP1 به صورت مستقل از GPX4 با کاهش کوآنزیم Q10 (یوبیکینون) به یوبیکینول و در نتیجه خنثی کردن رادیکالهای لیپیدی، به مقاومت در برابر فروپتوز کمک میکند۹،۱۰. در حالی که نقش آن در متاستاز نامشخص است، FSP1 در چندین سرطان، از جمله ملانوما، بیش از حد بیان میشود۹،۱۰. دادههای TCGA در ملانومای متاستاتیک همبستگی منفی بین بیان FSP1 و GCLC را نشان داد (شکل تکمیلی 1q).
برای بررسی بیشتر این رابطه، ما سطوح پروتئین FSP1، GCLC و GPX4 را با استفاده از ایمونوهیستوشیمی (IHC) در یک ریزآرایه بافتی ملانومای انسانی (TMA) شامل تومورهای اولیه و متاستازهای غدد لنفاوی تحلیل کردیم. در حالی که همبستگیهای مشاهده شده جزئی بودند و این تحلیلهای IHC بین بیان در سلولهای توموری و بیان در سلولهای ایمنی تمایزی قائل نمیشوند، FSP1 به سمت همبستگی مثبت با GCLC در تومورهای اولیه گرایش داشت، اما در متاستازهای غدد لنفاوی به سمت همبستگی منفی با هر دو GCLC و GPX4 متمایل بود (شکل تکمیلی 1r,s,u). در مقابل، GCLC و GPX4 هم در زمینه زیرجلدی و هم در غدد لنفاوی همبستگی مثبت خود را حفظ کردند (شکل تکمیلی 1t,u). با این حال، این همبستگیهای جزئی باید با احتیاط تفسیر شوند، زیرا سطوح بیان کلی ممکن است لزوماً منعکسکننده فعالیت عملکردی FSP1 نباشد.
تأثیرات اپیژنتیک و NRF2 بر GCLC و FSP1
در ادامه به بررسی تأثیرات بالقوه اپیژنتیکی و رونویسی بر بیان GCLC و FSP1 در ردههای متاستاتیک غدد لنفاوی پرداختیم. اختلال در تنظیم اپیژنتیکی یکی از ویژگیهای رایج سرطانهای انسانی است که به تومورزایی و حفظ فنوتیپهای بدخیم کمک میکند۱۹. پیش از این توصیف شده است که استقرار در غدد لنفاوی باعث تغییرات اپیژنتیکی قابل توجهی در سلولهای متاستاتیک ملانوما در غدد لنفاوی میشود۱۵ (شکل تکمیلی 2a). تحلیل سنجش کروماتین قابل دسترس برای ترانسپوزاز با استفاده از توالییابی (ATAC–seq) نشان داد که دسترسیپذیری کروماتین در جایگاه شروع رونویسی و پروموتر Gclc در ردههای متاستاتیک غدد لنفاوی در مقایسه با رده اولیه کاهش یافته است (شکل تکمیلی 2b). در مقابل، هیچ تفاوتی در دسترسیپذیری کروماتین در پروموتر Fsp1 در ردههای متاستاتیک غدد لنفاوی در مقایسه با رده اولیه مشاهده نشد، اما افزایشی در دسترسیپذیری کروماتین در مناطق دوردست (اینهنسرهای احتمالی) وجود داشت (شکل تکمیلی 2c). با توجه به تغییرات جزئی در دسترسیپذیری کروماتین، ما تنظیم رونویسی بالقوه را بیشتر ارزیابی کردیم و در ابتدا بر NRF2 به دلیل نقش تثبیتشده آن در استرس اکسیداتیو تمرکز کردیم.
NRF2 یک تنظیمکننده کلیدی پاسخ به استرس اکسیداتیو است و بیان چندین ژن درگیر در تنظیم فروپتوز، از جمله Gclc، Slc7a11 و Lrp8 را کنترل میکند۲۰. همچنین نشان داده شده است که NRF2 بر بیان Fsp1 در زمینههای خاصی تأثیر میگذارد۲۱. بنابراین، در ادامه بیان NRF2 و اهداف اصلی پاییندستی آن را در ردههای متاستاتیک اولیه در مقابل غدد لنفاوی اندازهگیری کردیم. اگرچه سطوح mRNA Nrf1، Nrf2 و Keap1 در طول نسلهای غدد لنفاوی تفاوت معناداری نداشت (شکل تکمیلی 2d-g)، ژنهای هدف کلیدی NRF2 مرتبط با فروپتوز در ردههای متاستاتیک غدد لنفاوی نسل آخر در مقایسه با نسلهای اولیه به طور متفاوتی تغییر کرده بودند (شکل تکمیلی 2h). سطوح پروتئین NRF2 نیز در ردههای متاستاتیک غدد لنفاوی نسل آخر در مقایسه با رده اولیه کاهش یافته بود (شکل تکمیلی 2i-k). علاوه بر این، بیان بیش از حد NRF2 در سلولهای اولیه به طور معناداری سطوح GCLC، GPX4 و FSP1 را افزایش داد، هرچند به میزان کمتری (شکل تکمیلی 2l,m).
در مجموع، این نتایج نشان میدهد که کاهش بیان Gclc در سلولهای متاستاتیک غدد لنفاوی ممکن است ناشی از تغییرات اپیژنتیکی در لوکوس Gclc و کاهش بیان و فعالیت NRF2 باشد. در مقابل، افزایش mRNA Fsp1 و کاهش سطوح پروتئین GPX4 در ردههای متاستاتیک غدد لنفاوی احتمالاً توسط مکانیسمهای مستقل از NRF2، به ترتیب شامل تنظیم اپیژنتیکی و پساترجمهای، هدایت میشود.
وابستگی به GPX4 در شرایط آزمایشگاهی در مقابل درونتنی
در ادامه، به دنبال درک چگونگی تغییر حساسیتها به القاکنندههای فروپتوز در طول نسلهای غدد لنفاوی بودیم. برای آزمودن این موضوع، ما حساسیت به فروپتوز این ردهها را در شرایط آزمایشگاهی ارزیابی کردیم و در این زمینه، ردههای متاستاتیک غدد لنفاوی حساسیت بیشتری نسبت به همتایان اولیه خود به مهارکنندههای GPX4، یعنی RSL3 و ML210، و همچنین به مهارکننده سیستم xc−، اراستین-۲، نشان دادند (شکل تکمیلی 3a-h). به طور سازگار، ردههای متاستاتیک غدد لنفاوی پس از تیمار با RSL3 در شرایط آزمایشگاهی، اکسیداسیون لیپیدی بالاتری (که توسط BODIPY-C11 شناسایی شد) نشان دادند (شکل تکمیلی 3i). در مقابل، سلولهای متاستاتیک غدد لنفاوی (LN7-1134BL) که از متاستازهای خودبهخودی غدد لنفاوی جدا شده بودند، در مقایسه با آنهایی که از تومور زیرجلدی جدا شده بودند، در شرایط برونتنی (ex vivo) حساسیت کمتری به اراستین-۲ یا مهار GPX4 داشتند (شکل تکمیلی 3j)، که تأیید میکند محافظت از فروپتوز با واسطه غدد لنفاوی در این ردههای سلولی باقی میماند، که با کار قبلی ما سازگار است۲.
همچنین، مطابق با یافتههای قبلی ما۲، پیشتیمار سلولهای اولیه با اسید اولئیک متصل به آلبومین در شرایط آزمایشگاهی، به طور کامل بقای سلول را پس از تیمار با RSL3 بازیابی کرد (شکل تکمیلی 3k). با این حال، پیشتیمار با اسید اولئیک تنها به طور جزئی بقای سلول را در ردههای متاستاتیک غدد لنفاوی بازیابی کرد (شکل تکمیلی 3k)، که با گرایشی به سمت کاهش سطوح پروتئین ACSL3 در برخی از ردههای متاستاتیک غدد لنفاوی و کاهش حساسیت تحت مهار دارویی ACSLها همبستگی داشت (شکل تکمیلی 3l,m). بنابراین، این مدل یک سیستم ارزشمند برای بررسی سازگاریهای سلولی پایدار ناشی از استقرار در غدد لنفاوی فراهم میکند، که از پاسخهای متابولیکی گذرا با واسطه محافظت اسید اولئیک متمایز و در عین حال مکمل آن است۲.
کاهش GSH در سلولهای متاستاتیک غدد لنفاوی
فروپتوز یک نوع متابولیک از مرگ سلولی است که در آن GSH نقش محافظتی حیاتی به عنوان یک کو-سوبسترای کلیدی مورد نیاز برای فعالیت GPX4 دارد۲۲. برای بررسی اینکه آیا تغییرات متابولیکی به افزایش حساسیت ردههای متاستاتیک غدد لنفاوی به مهار GPX4 یا سیستم \({{\rm{x}}}_{{\rm{c}}}^{-}\) در شرایط آزمایشگاهی کمک میکند، ما متابولومیکس بدون سوگیری انجام دادیم که خوشهبندی متمایزی بین ردههای اولیه و متاستاتیک غدد لنفاوی را نشان داد (شکل 2a). بیش از ۵۰ متابولیت، از جمله چندین متابولیت مرتبط با میتوکندری، به طور قابل توجهی در سلولهای متاستاتیک غدد لنفاوی تغییر کرده بودند (P < 0.001؛ شکل 2b). با این حال، ما تفاوتهای قابل توجهی بین ردههای سلولی اولیه و متاستاتیک غدد لنفاوی با استفاده از سنجش Seahorse مشاهده نکردیم (شکل تکمیلی 4a). تحلیل متابولومیک تفاوتهای قابل توجهی را در متابولیتهای درگیر در سنتز GSH بین ردههای اولیه و متاستاتیک غدد لنفاوی شناسایی کرد (شکل 2b,c)، از جمله کاهش گلوتامات (شکل 2d,e) و GSH احیا شده و اکسید شده (شکل 2f-i). این تغییرات هم با کروماتوگرافی مایع همراه با طیفسنجی جرمی پشت سر هم (LC–MS/MS) و هم با یک سنجش مستقل مبتنی بر لومینسانس تأیید شد (شکل 2j). اگرچه بیان GCLC در ردههای متاستاتیک غدد لنفاوی کاهش یافته بود (شکل 1b,d-f)، بیان سایر آنزیمهای سنتز GSH، مانند GCLM و GSS، به طور قابل توجهی تغییر نکرده بود (شکل تکمیلی 4b,c).
a، تحلیل مؤلفه اصلی (PCA) پروفایلهای متابولومیک از ردههای B16-F0 (اولیه) و LN1، 7–9. b، ۲۵ متابولیت برتر که به طور متفاوتی در ردههای LN7-9 در مقایسه با ردههای LN1 و اولیه تغییر کردهاند. c، نمودار مسیر سنتز GSH. این نمودار با استفاده از BioRender ایجاد شده است. d،f،h، کمیسازی با LC-MS/MS برای گلوتامات (d)، GSH (f) و GSSG (h). e،g،i، کمیسازی گروهی به ترتیب برای d،f و h. j، کمیسازی GSH مبتنی بر لومینسانس با یا بدون تخلیه سیستئین. برای d–j، n = ۳ آزمایش مستقل. برای d–j، دادهها به صورت میانگین ± انحراف معیار نشان داده شدهاند. تحلیل آماری با استفاده از ANOVA یکطرفه و به دنبال آن آزمون Dunnett (d،f،h و j) و آزمون تی-استیودنت دوطرفه غیرجفتی با تصحیح Welch (e،g و i) انجام شد. GSSG، گلوتاتیون دیسولفید.
با توجه به نیاز به سیستئین برای سنتز GSH از نو از طریق GCLC، ما سطوح GSH را در شرایط تخلیه سیستئین آزمایش کردیم. تخلیه ال-سیستئین سطوح GSH را هم در ردههای اولیه و هم در ردههای متاستاتیک غدد لنفاوی کاهش داد، با کاهش بیشتری که در سلولهای متاستاتیک غدد لنفاوی مشاهده شد (شکل 2j)، که نشاندهنده اختلال در سنتز GSH وابسته به سیستئین است. ادغام پروفایلهای ترانسکریپتومیک و متابولومیک بیشتر تأیید کرد که بیان GCLC و متابولیسم GSH از جمله ژنها و مسیرهایی بودند که بیشترین تفاوت را در تنظیم در سلولهای متاستاتیک غدد لنفاوی در مقایسه با سلولهای اولیه داشتند (شکل تکمیلی 4d,e). این یافتهها نشان میدهد که کاهش بیان GCLC در ردههای متاستاتیک غدد لنفاوی ممکن است به اختلال در سنتز GSH کمک کند.
اکسیژن سطوح پروتئین GPX4 را تنظیم میکند
ریزمحیط لنف و غدد لنفاوی حاوی چندین عامل تنظیمکننده فروپتوز است، از جمله آهن آزاد کم، اسید اولئیک بالا و سطوح اکسیژن کاهش یافته (۱-۳٪)۲،۱۸. در ادامه، ما بررسی کردیم که آیا اسید اولئیک، اکسیژن یا سطوح GSH بیان GCLC، GPX4 و FSP1 را در سلولهای ملانومای اولیه تنظیم میکنند تا سهم آنها در مقاومت به فروپتوز را ارزیابی کنیم. مکمل اسید اولئیک سطوح پروتئین GPX4، GCLC یا FSP1 را در شرایط کشت استاندارد (۲۱٪ اکسیژن) تغییر نداد (شکل تکمیلی 5a). قابل توجه است که قرار گرفتن در معرض سطوح ۱٪ اکسیژن، سطوح پروتئین GPX4 را به طور مستقل از اسید اولئیک کاهش داد (شکل تکمیلی 5a)، که نشان میدهد اکسیژن ممکن است به کاهش بیان GPX4 مشاهده شده در ردههای متاستاتیک غدد لنفاوی کمک کند.
با توجه به اینکه سطوح GSH در لنف نسبت به پلاسما بالاتر است۲، در ادامه آزمایش کردیم که آیا GSH خارجی (GSH-اتیل استر، GSHee) میتواند الگوهای بیان پروتئین مشاهده شده در ردههای متاستاتیک غدد لنفاوی را بازتولید کند. GSHee سطوح GPX4 را در شرایط ۲۱٪ اکسیژن افزایش داد اما بیان GCLC یا FSP1 را تغییر نداد (شکل تکمیلی 5b,c). در شرایط ۱٪ اکسیژن، GPX4 نیز کاهش یافت اما تا حدی توسط GSHee بازیابی شد (شکل تکمیلی 5b,c). با این حال، بیان بیش از حد GCLC سطوح GPX4 را در ردههای اولیه و متاستاتیک غدد لنفاوی در شرایط ۲۱٪ یا ۱٪ اکسیژن بازنگرداند (شکل تکمیلی 5d-g)، و مهار GCLC از طریق L-BSO تنها در شرایط هیپوکسی GPX4 را بیشتر کاهش داد، در حالی که در شرایط ۲۱٪ اکسیژن تأثیری نداشت (شکل تکمیلی 5h,i). به طور مشابه با بیان بیش از حد GCLC، ردههای Gclc-KO کاهش GPX4 را در شرایط ۱٪ اکسیژن در مقایسه با ردههای Gclc-WT نشان ندادند (شکل تکمیلی 5j,k).
یک آزمایش زمانبندی شده در ۱٪ اکسیژن تأیید کرد که سطوح پروتئین GPX4 به تدریج با گذشت زمان در ۱٪ اکسیژن کاهش مییابد (شکل 3a,b)، که پس از اکسیژنرسانی مجدد به سرعت معکوس شد (شکل 3c,d). به طور مشابه، تیمار با CoCl۲—یک القاکننده شیمیایی هیپوکسی—منجر به اثرات مشابهی شد، از جمله پایدارسازی HIF-1α و کاهش سطوح پروتئین GPX4 (شکل تکمیلی 5l). کاهش سطوح پروتئین GPX4 در شرایط دسترسی کمتر به اکسیژن هم در سلولهای اولیه و هم در سلولهای متاستاتیک غدد لنفاوی (شکل تکمیلی 5m,n) و در چندین رده ملانومای موش و انسان مشاهده شد (شکل تکمیلی 5o). علاوه بر این، سطوح ۵٪ اکسیژن نیز سطوح پروتئین GPX4 را در ردههای اولیه و متاستاتیک غدد لنفاوی در مقایسه با ۲۱٪ اکسیژن کاهش داد (شکل تکمیلی 5p-s). در مجموع، این یافتهها مشاهدات قبلی ما را تقویت میکنند و بر دسترسی به اکسیژن به عنوان یک تنظیمکننده حیاتی محور نظارتی GPX4 در ملانوما تأکید دارند.
a، ایمونوبلات HIF-1α و GPX4 در B16-F0 تحت ۱٪ اکسیژن برای ۱۶، ۲۴ و ۴۸ ساعت. b، کمیسازی GPX4 از a. c، ایمونوبلات HIF-1α و GPX4 پس از اکسیژنرسانی مجدد. سلولهای B16-F0 به مدت ۲۴ ساعت تحت ۱٪ اکسیژن کشت داده شدند، سپس به مدت ۲، ۴ یا ۸ ساعت در معرض ۲۱٪ اکسیژن قرار گرفتند. d، کمیسازی از c. e، تحلیل میکروسکوپ کانفوکال از GPX4 (سبز) و میتوکندری (MitoView؛ سرخابی) تحت ۲۱٪ و ۱٪ اکسیژن برای ۲۴ ساعت. میلههای مقیاس، ۵۰ میکرومتر. f، فراکشنبندی زیرسلولی GPX4 تحت ۲۱٪ و ۱٪ اکسیژن برای ۲۴ ساعت. g،i، سطوح پروتئین GPX4 در سلولهای B16-F0 و LN7-1134BL تیمار شده با مهارکنندههای پروتئازوم (BTZ (۱۰ نانومولار) (g) یا MG-132 (۰.۵ میکرومولار) (i)) تحت ۲۱٪ یا ۱٪ اکسیژن برای ۲۴ ساعت. h،j، کمیسازی آزمایشهای به ترتیب در g و i. k، سطوح mRNA Gpx4 با یا بدون BTZ (۱۰ نانومولار) تحت ۲۱٪ یا ۱٪ اکسیژن برای ۲۴ ساعت. l، ایمونوپرسیپیتاسیون و یوبیکوئیتیناسیون GPX4 در رده LN7-1134BL تحت ۲۱٪ یا ۱٪ اکسیژن برای ۱۶ ساعت. LE، نوردهی طولانی؛ SE، نوردهی کوتاه. m، بقای سلولی ردههای B16-F0 و متاستاتیک غدد لنفاوی تیمار شده با ML-210 تحت ۲۱٪ یا ۱٪ اکسیژن برای ۴۸ ساعت. n، سطوح کل GSH در ردههای اولیه و متاستاتیک غدد لنفاوی تحت ۲۱٪ یا ۱٪ اکسیژن برای ۲۴ ساعت. n = ۳ (a–e، g–l و n) و n = ۲ (f) آزمایش مستقل. برای m، n = ۳ تکرار فنی، نماینده ۱ از ۳ آزمایش مستقل. برای b، d، h، j، k و n، دادهها به صورت میانگین ± انحراف معیار نشان داده شدهاند. تحلیل آماری با استفاده از آزمونهای کروسکال-والیس و به دنبال آن آزمون مقایسه چندگانه دان (b، d، h و j) و ANOVA یکطرفه و به دنبال آن آزمون توکی (k) یا آزمون پست-هاک شیداک (m و n) انجام شد.
اکسیژن کم، تخریب GPX4 را افزایش میدهد
اگرچه GPX4 عمدتاً سیتوپلاسمی است، اما در هسته، میتوکندری و سایر جایگاههای زیرسلولی نیز گزارش شده است۲۳،۲۴. تحلیلهای ایمونوفلورسانس کانفوکال و فراکشنبندی زیرسلولی نشان داد که در شرایط ۱٪ اکسیژن، سطوح پروتئین GPX4 عمدتاً در سیتوپلاسم کاهش مییابد در حالی که سطوح GPX4 در هسته و میتوکندری حفظ میشود (شکل 3e,f). برای درک مکانیسم مولکولی اساسی که از طریق آن دسترسی به اکسیژن ممکن است سطوح سیتوپلاسمی GPX4 را در ملانوما تنظیم کند، ابتدا دخالت تنظیمکنندههای شناختهشده GPX4، از جمله آنتیاکسیدانها، سلنیوم۲۵، تخریب اتوفاژیک GPX4۲۶،۲۷ و تخریب GPX4 با واسطه سیستم یوبیکوئیتین-پروتئازوم (UPS)۲۸،۲۹،۳۰ را بررسی کردیم. تیمار با آنتیاکسیدانها (N-استیل سیستئین) و مهارکننده فروپتوز لیپروکستاتین-۱ سطوح پروتئین GPX4 را در شرایط ۱٪ اکسیژن بازیابی نکرد (شکل تکمیلی 6a,b)، در حالی که مکمل سلنیوم و مهار اتوفاژی توسط کلروکین (CQ) به طور جزئی سطوح GPX4 را در این شرایط بازیابی کرد (شکل تکمیلی 6c-e). در مقابل، مهارکنندههای پروتئازوم بورتزومیب (BTZ) و MG-132 به طور قابل توجهی سطوح پروتئین GPX4 را در ردههای اولیه (B16-F0) و متاستاتیک غدد لنفاوی (LN7-1134BL) در شرایط کمبود اکسیژن بازیابی کردند (شکل 3g-j). به طور مشابه، مهار آنزیم فعالکننده یوبیکوئیتین (E1) با استفاده از NSC 624206 سطوح پروتئین GPX4 را در شرایط ۱٪ اکسیژن بازیابی کرد، که در نتیجه دلالت بر تخریب GPX4 با واسطه UPS دارد (شکل تکمیلی 6f,g). برای رد اثرات رونویسی، ما سطوح mRNA Gpx4 و Nrf2 را اندازهگیری کردیم و هیچ تغییر قابل توجهی پس از قرار گرفتن در معرض ۱٪ اکسیژن یا تیمار با BTZ مشاهده نکردیم (شکل 3k و شکل تکمیلی 6h). برای تأیید اینکه GPX4 در شرایط کمبود اکسیژن توسط UPS یوبیکوئیتینه و تنظیم میشود، ما یوبیکوئیتیناسیون GPX4 را در شرایط ۲۱٪ و ۱٪ اکسیژن ارزیابی کردیم. قرار گرفتن در معرض ۱٪ اکسیژن باعث القاء HIF-1α و کاهش سطوح پروتئین GPX4 شد؛ با این حال، ایمونوپرسیپیتاسیون GPX4 اندوژن افزایش یوبیکوئیتیناسیون را به طور خاص در شرایط ۱٪ اکسیژن نشان داد، اما نه در ۲۱٪ اکسیژن (شکل 3l و شکل تکمیلی 6i). در مجموع، این نتایج نشان میدهند که دسترسی به اکسیژن پایداری پروتئین GPX4 را از طریق تخریب با واسطه UPS تنظیم میکند، که به کاهش سطوح GPX4 مشاهده شده در سلولهای ملانومای متاستاتیک غدد لنفاوی کمک میکند.
اکسیژن حساسیت به فروپتوز را تنظیم میکند
با توجه به اینکه ردههای متاستاتیک غدد لنفاوی در شرایط کشت استاندارد (۲۱٪ اکسیژن) در مقایسه با رده اولیه در شرایط آزمایشگاهی به RSL3، ML-210 و اراستین-۲ حساستر هستند (شکل تکمیلی 3a-h) و اینکه سطوح پروتئین GPX4 با کمبود اکسیژن کاهش مییابد، در ادامه بررسی کردیم که آیا دسترسی به اکسیژن حساسیت به مهارکنندههای GPX4 و سیستم \({{\rm{x}}}_{{\rm{c}}}^{-}\) را تنظیم میکند یا خیر. در شرایط ۱٪ اکسیژن، هم ردههای اولیه و هم ردههای متاستاتیک غدد لنفاوی حساسیت کمتری به مهار GPX4 (ML-210 یا RSL3) و مهار سیستم \({{\rm{x}}}_{{\rm{c}}}^{-}\) (اراستین-۲) نشان دادند (شکل 3m و شکل تکمیلی 6j,k). علاوه بر این، سطوح GSH در شرایط ۱٪ اکسیژن هم در ردههای اولیه و هم در ردههای متاستاتیک غدد لنفاوی کاهش یافت (شکل 3n). این یافتهها اهمیت در نظر گرفتن عوامل ریزمحیطی غدد لنفاوی، مانند دسترسی به اکسیژن، را که به طور قابل توجهی محور GCLC–GSH–GPX4 و حساسیت سلولهای ملانوما به فروپتوز را تنظیم میکنند، برجسته میسازد. با توجه به افزایش بیان مشاهدهشده FSP1 در ردههای متاستاتیک غدد لنفاوی، در ادامه به بررسی تنظیم و پتانسیل درمانی آن در سلولهای ملانوما در داخل غدد لنفاوی پرداختیم.
FSP1 لیزوزومی در ردههای متاستاتیک غدد لنفاوی
FSP1 نقش محافظتی مهمی در خنثیسازی اکسیداسیون لیپیدها دارد۹،۱۰. با این حال، تنظیم و زمینههای پاتوفیزیولوژیکی که در آن FSP1 ممکن است در سرطان هدف قرار گیرد، هنوز نامشخص است. FSP1 برای عملکرد ضد فروپتوزی خود تحت N-میریستویلاسیون و استقرار در غشاء قرار میگیرد۹،۱۰؛ بنابراین، ما ابتدا موقعیت FSP1 را در ردههای متاستاتیک غدد لنفاوی مشخص کردیم. FSP1 به طور قابل توجهی در موقعیت اطراف هستهای در سلولهای متاستاتیک غدد لنفاوی در مقایسه با رده اولیه قرار داشت (شکل 4a,b). N-میریستویلاسیون پروتئین یک آسیلاسیون چربی است که توسط N-میریستویلترانسفرازها (NMTs) کاتالیز میشود. گروه میریستویل اضافه شده به پروتئین برای موقعیتیابی سلولی و انتقال سیگنال حیاتی است۳۱. ارتباط FSP1 با اطراف هسته توسط IMP-1088، یک مهارکننده قوی N-میریستویلترانسفراز، کاهش یافت، که اهمیت میریستویلاسیون FSP1 را در ارتباط با اندوممبرانهای اطراف هستهای در ردههای متاستاتیک غدد لنفاوی تأیید میکند (شکل 4a,b).
a، تصاویر کانفوکال از FSP1-OFP (سبز) در سلولهای B16-F0 (اولیه)، LN7-1134BL، LN8-1194BR و LN9-1315BL با یا بدون IMP-1088 (۰.۱ میکرومولار) به مدت ۲۴ ساعت. هستهها (N؛ DAPI؛ آبی) با خطچین مشخص شدهاند. b، کمیسازی FSP1-OFP اطراف هستهای در ردههای B16-F0، LN7، LN8 و LN9. B16-F0: n = ۱۹۴ (بدون IMP-1088)، n = ۱۹۳ (با IMP-1088)؛ LN7-1134BL: n = ۱۸۷ (بدون IMP-1088)، n = ۲۲۱ (با IMP-1088)؛ LN8-1194BR: n = ۲۱۱ (بدون IMP-1088)، n = ۱۹۳ (با IMP-1088)؛ LN9-1315BL: n = ۱۴۸ (بدون IMP-1088)، n = ۱۶۲ (با IMP-1088). c، هممکانی FSP1-OFP (سبز) با نشانگرهای لیزوزومی (LAMP1؛ سرخابی)، گلژی (RCAS1؛ قرمز) یا شبکه آندوپلاسمی (ER) (ERp72؛ قرمز). پروفایلهای شدت فلورسانس در طول فلشهای نشان داده شده در تصاویر اندازهگیری شدهاند. هستهها (DAPI؛ آبی) با خطچین مشخص شدهاند. d، نمای ایمونوفلورسانس متعامد از تصاویر پشتهای FSP1-OFP (سبز) و LAMP1 (سرخابی). هستهها (DAPI؛ آبی) با خطچین مشخص شدهاند. e، ایمونوبلات عصارههای غنی از لیزوزوم و سلول کامل. LAMP1، LAMP2 و LIMPII به عنوان نشانگرهای لیزوزومی و γ-توبولین به عنوان نشانگر عصاره سلول کامل استفاده شدند. f، کمیسازی سطوح پروتئین FSP1 در عصارههای سلول کامل (n = ۹)، غنی از لیزوزوم (n = ۵)، غنی از گلژی (n = ۴) و غنی از ER (n = ۴). g، کمیسازی هممکانی FSP1-OFP (سبز) و LAMP1 (سرخابی) در سلولهای B16-F0، LN7-1134BL، LN8-1194BR و LN9-1315BL با یا بدون IMP-1088 (۰.۱ میکرومولار) به مدت ۲۴ ساعت. B16-F0: n = ۱۰۵ (بدون IMP-1088)، n = ۶۸ (با IMP-1088)؛ LN7-1134BL: n = ۱۰۴ (بدون IMP-1088)، n = ۱۰۱ (با IMP-1088)؛ LN8-1194BR: n = ۹۴ (بدون IMP-1088)، n = ۷۶ (با IMP-1088)؛ LN9-1315BL: n = ۶۳ (بدون IMP-1088)، n = ۶۴ (با IMP-1088). h، میکروسکوپ کانفوکال FSP1-OFP (سبز) و Lysotracker (سرخابی) در LN8-1194BR با یا بدون IMP-1088 (۰.۱ میکرومولار) به مدت ۲۴ ساعت. هستهها (Hoechst؛ آبی) با خطچین مشخص شدهاند. i، کمیسازی هممکانی FSP1-OFP و Lysotracker از h. n = ۹۲ (بدون IMP-1088) و n = ۹۴ (با IMP-1088). j، تصاویر کانفوکال از سلولهای LN7-1134BL که FSP1-OFP نوع وحشی (WT) یا جهشیافته G2A را بیان میکنند، که با LAMP1 (سرخابی) و DAPI (آبی) همزمان رنگآمیزی شدهاند. n = ۳ (a–d، g و j) و ۴ (h و i) آزمایش مستقل. برای g و i، دادهها به صورت نمودارهای ویولن با تمام نقاط نشان داده شدهاند؛ میانه با یک خط تیره مشخص شده است. برای b و f، دادهها به صورت میانگین ± انحراف معیار هستند. میلههای مقیاس، ۵۰ میکرومتر (a)، ۱۰ میکرومتر (c) و ۵ میکرومتر (d، h و j). تحلیل آماری با استفاده از ANOVA یکطرفه با آزمون مقایسه چندگانه شیداک (b)، آزمون توکی (g)، آزمون کروسکال-والیس با آزمون پست-هاک دان (f) یا آزمون تی-استیودنت دوطرفه غیرجفتی با تصحیح ولچ (i) انجام شد.
نشان داده شده است که FSP1 در غشای پلاسما، قطرات چربی، ساختارهای اطراف هستهای و میتوکندری قرار میگیرد۹،۱۰. در سلولهای متاستاتیک غدد لنفاوی، FSP1 اطراف هستهای با قطرات چربی یا میتوکندری هممکانی نداشت (شکل تکمیلی 7a). با توجه به اینکه FSP1 در ناحیه اطراف هستهای ردههای متاستاتیک غدد لنفاوی قرار داشت، ما ارتباط آن را با اندامکهای اطراف هستهای، از جمله شبکه آندوپلاسمی (ER)، گلژی و لیزوزومها، بیشتر بررسی کردیم. تحلیل ایمونوفلورسانس نشان داد که FSP1 عمدتاً با لیزوزومهای اطراف هستهای در ردههای متاستاتیک غدد لنفاوی هممکان است (شکل 4c). تحلیل پشتهای ایمونوفلورسانس FSP1 و LAMP1 تأیید کرد که FSP1 در سراسر محفظه لیزوزوم توزیع شده است (شکل 4d). فراکشنبندی بیوشیمیایی و غنیسازی لیزوزومها، گلژی و ER افزایش قابل توجهی در FSP1 لیزوزومی را در ردههای متاستاتیک غدد لنفاوی در مقایسه با ردههای سلولی اولیه تأیید کرد، در حالی که سطوح FSP1 در گلژی و ER بین ردههای اولیه و متاستاتیک غدد لنفاوی قابل مقایسه بود (شکل 4e,f و شکل تکمیلی 7b,c).
FSP1 با لیزوزومهای اطراف هستهای هم در شرایط ۲۱٪ اکسیژن (شکل 4g-i و شکل تکمیلی 7d,e) و هم در شرایط ۱٪ اکسیژن (شکل تکمیلی 7f) هممکانی داشت. فعالیت NMT1 و NMT2 برای ارتباط FSP1 با لیزوزومها ضروری بود (شکل 4g-i و شکل تکمیلی 7d-f). در واقع، جهشیافته FSP1 G2A، که نمیتواند N-میریستویلاسیون شود، تأیید کرد که N-میریستویلاسیون برای مکانیابی لیزوزومی FSP1 در ردههای متاستاتیک غدد لنفاوی ضروری است (شکل 4j و شکل تکمیلی 7g). ارتباط FSP1 با لیزوزومها همچنین در سلولهای SK-MEL5 و MeWo – دو رده ملانومای متاستاتیک انسانی که از غدد لنفاوی زیر بغل جدا شدهاند۳۲ – و همچنین در سلولهای A-375 (جدا شده از تومور اولیه) مشاهده شد (شکل تکمیلی 7h). بنابراین، ارتباط FSP1 با لیزوزومهای اطراف هستهای در موش و انسان حفظ شده است (شکل تکمیلی 7i) و به زمینههایی فراتر از محیط غدد لنفاوی، همانطور که در رده سلولی A-375 مشاهده شد، قابل تعمیم است.
برای بررسی اینکه آیا فعالیت لیزوزومی بر سطوح پروتئین FSP1 تأثیر میگذارد، ما از بافیلومایسین A (BafA1) و CQ برای مهار فعالیت لیزوزومی استفاده کردیم. سطوح پروتئین FSP1 پس از تیمار با BafA1 در رده اولیه و ردههای متاستاتیک غدد لنفاوی بدون تغییر باقی ماند (شکل تکمیلی 8a-d). نتایج مشابهی با تیمار CQ مشاهده شد (شکل تکمیلی 8e,f). در مجموع، این دادهها نشان میدهند که ارتباط لیزوزومی FSP1 به تخریب آن کمک نمیکند.
لیزوزومها اخیراً به عنوان اندامکی درگیر در تنظیم و اجرای فروپتوز شناخته شدهاند۳۳،۳۴. شواهد اخیر نشان میدهد که قرار گرفتن در معرض شرایط هیپوکسیک منجر به افزایش pH لیزوزومی میشود۳۵. قابل توجه است که فعالیت آنزیمی FSP1 تا حد زیادی تحت تأثیر نوسانات pH به صورت وابسته به غلظت باقی میماند و عملکرد خود را حتی در محیط اسیدی معمول لیزوزومها یا سایر اندامکها حفظ میکند (شکل تکمیلی 8g,h). یک مطالعه اخیر فنتومایسینها را توسعه داد—خانوادهای مصنوعی از مولکولهای کوچک۳۴. فنتومایسین از یک بخش هدفگیرنده لیزوزوم متصل به یک لیگاند فعالکننده آهن تشکیل شده است که امکان فعالسازی آهن لیزوزومی و القاء فروپتوز را فراهم میکند. در واقع، دوزهای زیرکشنده فنتومایسین-۱ سطوح mRNA FSP1 را در سلولهای HT-1080 افزایش داد۳۴. با توجه به مکانیابی لیزوزومی FSP1 در سلولهای متاستاتیک غدد لنفاوی، ما فرض کردیم که عدم وجود FSP1 لیزوزومها را به اکسیداسیون لیپیدی ناشی از فنتومایسینها حساس میکند. در واقع، سلولهای LN7-1134BL Fsp1-KO (شکل تکمیلی 8i,j) پس از تیمار با فنتومایسین-۳ در مقایسه با سلولهای نوع وحشی، اکسیداسیون لیپیدی افزایش یافتهای را نشان دادند (شکل تکمیلی 8k). این دادهها نشان میدهند که محیط غدد لنفاوی نه تنها بیان FSP1 را القاء میکند، بلکه به طور عملکردی FSP1 را در غشاهای لیزوزومی برای سرکوب اکسیداسیون لیپیدی تحت استرس فروپتوتیک درگیر میکند.
مهار FSP1 و GCLC بقا را در شرایط آزمایشگاهی مختل میکند
برای تعیین اینکه آیا FSP1 یک آسیبپذیری قابل هدفگیری در ردههای غدد لنفاوی است، ابتدا مقاومت به فروپتوز را در ردههای متاستاتیک اولیه و غدد لنفاوی نوع وحشی (WT) و Fsp1-KO تحت تیمار با RSL3 یا ML-210 در شرایط ۲۱٪ و ۱٪ اکسیژن مقایسه کردیم. همانطور که انتظار میرفت، ردههای Fsp1-KO به تیمار RSL3 در شرایط ۲۱٪ اکسیژن حساستر بودند (شکل تکمیلی 9a-d). در شرایط ۱٪ اکسیژن، اگرچه حساسیت کلی به مهار GPX4 کاهش یافته بود، ردههای Fsp1-KO در مقایسه با ردههای WT محافظت به طور قابل توجهی کمتری نشان دادند (شکل 5a,b و شکل تکمیلی 9b). قابل توجه است که محافظت RSL3 در طول نسلهای غدد لنفاوی در ردههای Fsp1-KO کاهش یافت و سلولهای LN9 Fsp1-KO بالاترین حساسیت را در شرایط ۱٪ اکسیژن نشان دادند (شکل 5b). روند مشابهی با تیمار ML-210 مشاهده شد، که در آن تنها ردههای متاستاتیک غدد لنفاوی Fsp1-KO در شرایط ۱٪ اکسیژن حساس باقی ماندند (شکل تکمیلی 9e,f).
a،b، بقای سلولی ردههای B16-F0 و LN7-1134BL نوع وحشی و Fsp1-KO (a) یا ردههای LN9-1315BL نوع وحشی و Fsp1-KO (b) تیمار شده با RSL3 تحت ۱٪ اکسیژن به مدت ۴۸ ساعت. c، سطوح اکسیداسیون لیپید (BODIPY-C11ox/red) ردههای B16-F0 WT، B16-F0 Fsp1-KO، LN7-1134BL WT و LN7-1134BL Fsp1-KO تحت ۲۱٪ (n = ۴) یا ۱٪ اکسیژن (n = ۴) با یا بدون لیپروکستاتین-۱ (۱ میکرومولار) (n = ۳) به مدت ۲۴ ساعت. d، بقای سلولی ردههای B16-F0 و LN8-1194BR تیمار شده با viFSP1 (۳۰ میکرومولار)، BSO (۱ میلیمولار)، لیپروکستاتین-۱ (۱ میکرومولار) یا ترکیبی از آنها تحت ۱٪ اکسیژن به مدت ۴۸ ساعت. e،f، بقای سلولی سلولهای MeWo (e) و SK-MEL5 (f) تیمار شده با مهارکنندههای FSP1 (iFSP1 و FSEN1، ۱۰ میکرومولار؛ icFSP1 و viFSP1، ۱۵ میکرومولار) با یا بدون BSO (۱۰۰ میکرومولار) و با یا بدون لیپروکستاتین-۱ (۱ میکرومولار) تحت ۲۱٪ (e و f) یا ۱٪ اکسیژن (f) به مدت ۲۴ ساعت. g، حجم نهایی تومور SK-MEL5 پس از درمان داخل توموری با وسیله نقلیه (n = ۱۹)، icFSP1 (n = ۸)، viFSP1 (n = ۱۰)، BSO (n = ۱۴) یا ترکیبی از BSO با icFSP1 (n = ۸) یا viFSP1 (n = ۱۰). دادهها نسبت به درمان با وسیله نقلیه نرمالسازی شدهاند. h، حجم نهایی تومور SK-MEL5 در موشهای تحت درمان داخل توموری با وسیله نقلیه (n = ۹) یا FSEN1 (n = ۸) که نسبت به درمان با وسیله نقلیه نرمالسازی شدهاند. i، حجم نهایی تومور در مقایسه تزریقهای داخل غده (i.n.) و زیرجلدی (s.c.) سلولهای LN7-1134BL نوع وحشی و Fsp1-KO تیمار شده با وسیله نقلیه یا viFSP1. i.n.: WT: وسیله نقلیه (n = ۷)، viFSP1 (n = ۱۰)؛ Fsp1 KO: وسیله نقلیه (n = ۹)، viFSP1 (n = ۸). s.c.: WT: وسیله نقلیه (n = ۷)، viFSP1 (n = ۸)؛ Fsp1 KO: وسیله نقلیه (n = ۸)، viFSP1 (n = ۵). j، تنظیم GCLC، GPX4 و FSP1 در ملانوما در غدد لنفاوی. نمودار با استفاده از BioRender ایجاد شده است. برای a، b و d–f، n = ۳ تکرار فنی، نماینده ۱ از ۳ آزمایش مستقل. برای g–i، n = ۲ آزمایش مستقل. برای a–c، دادهها به صورت میانگین ± انحراف معیار هستند. برای g–i، نمودارهای جعبه و خط تمام نقاط را نشان میدهند، با خطوطی که مقادیر حداقل تا حداکثر را نشان میدهند. حدود جعبه نشاندهنده چارکهای اول و سوم (Q1–Q3) و خط مرکزی نشاندهنده میانه (Q2) است. معناداری آماری با استفاده از آزمونهای کروسکال-والیس و به دنبال آن آزمون پست-هاک دان (c)، ANOVA یکطرفه و به دنبال آن آزمون مقایسه چندگانه توکی (d) با آزمون مقایسه چندگانه شیداک (e–g و i) و آزمون تی-استیودنت دوطرفه غیرجفتی با تصحیح ولچ (h) تعیین شد.
برای تأیید اهمیت FSP1 در شرایط دسترسی کمتر به اکسیژن، ما اکسیداسیون لیپید را در هر دو سلول WT و Fsp1-KO از ردههای اولیه و LN7 در شرایط ۲۱٪ و ۱٪ اکسیژن اندازهگیری کردیم. قرار گرفتن در معرض ۱٪ اکسیژن، رنگآمیزی BODIPY-C11 را در تمام ردهها افزایش داد (شکل 5c)، اما به میزان بیشتری در رده LN7-1134BL Fsp1-KO (شکل 5c)، که بر اهمیت عملکردی FSP1 در شرایط کاهش دسترسی به اکسیژن تأکید میکند.
چندین مهارکننده مولکول کوچک FSP1 اخیراً توسعه یافتهاند، از جمله iFSP1۱۰، FSEN1۳۶ و icFSP1۳۷، که عمدتاً FSP1 انسانی را از طریق مکانیسمهای مختلف هدف قرار میدهند. viFSP1 اولین مهارکننده بینگونهای برای FSP1 است که علیه FSP1 موش و انسان مؤثر است۳۸. viFSP1 در ترکیب با دوزهای پایینتر RSL3 به طور قابل توجهی بقای ردههای متاستاتیک غدد لنفاوی را کاهش داد، اما در رده اولیه در شرایط ۱٪ اکسیژن اینطور نبود (شکل تکمیلی 9g). با این حال، مهار FSP1 به تنهایی برای القاء فروپتوز در شرایط آزمایشگاهی کافی نبود۸، از جمله در ردههای متاستاتیک غدد لنفاوی (شکل تکمیلی 9h).
اگرچه بیان GCLC و سطوح GSH در ردههای متاستاتیک غدد لنفاوی کاهش یافته است، اما کاملاً از بین نرفتهاند، که نشاندهنده یک فرصت قابل هدفگیری در ترکیب با مهار FSP1 است. GCLC به عنوان یک هدف فروپتوز مورد توجه قرار گرفته است۱۷،۳۹. با این حال، زمینههایی که در آن مهار GCLC مؤثر است، هنوز نامشخص است. برای ارزیابی تأثیر هدفگیری دوگانه، ما مهار ژنتیکی و دارویی FSP1 را در ترکیب با مهار دارویی GCLC با استفاده از L-BSO آزمایش کردیم. این ترکیب به طور قابل توجهی بقای LN8-1194BR را در شرایط ۱٪ اکسیژن در مقایسه با سلولهای اولیه کاهش داد (شکل 5d). Fsp1 KO در سلولهای اولیه B16-F0 هیچ تأثیری بر بقا پس از تیمار با L-BSO نداشت، در حالی که Fsp1-KO در LN7-1134BL منجر به کاهش بقا در شرایط ۱٪ اکسیژن شد، که وابستگی انتخابی به FSP1 را برجسته میکند (شکل تکمیلی 9i).
مشابه ردههای متاستاتیک غدد لنفاوی موش، ردههای ملانومای انسانی مشتق از غدد لنفاوی، از جمله MeWo و SK-MEL5۳۲، حساسیت بیشتری به L-BSO و مهارکنندههای FSP1 (iFSP1، FSEN1، icFSP1، viFSP1) در مقایسه با رده A-375 مشتق از تومور اولیه نشان دادند (شکل 5e,f و شکل تکمیلی 9j,k). قابل توجه است که SK-MEL5 به مهار ترکیبی FSP1 و GCLC هم در شرایط ۲۱٪ و هم در ۱٪ اکسیژن حساس بود – اثری که با لیپروکستاتین-۱ بازیابی شد (شکل 5f). این یافتههای آزمایشگاهی از هدفگیری همزمان FSP1 و GCLC در شرایط درونتنی برای کاهش رشد تومور در غدد لنفاوی پشتیبانی میکنند.
مهار FSP1 رشد تومور غدد لنفاوی را کاهش میدهد
برای بررسی اهمیت دارویی هدف قرار دادن FSP1 و/یا GCLC در تومورهای ملانوما در غدد لنفاوی، سلولهای SK-MEL5 به صورت داخل غده لنفاوی پوپلیتهآل موشهای NSG تزریق شدند. پس از قابل لمس شدن، موشها به مدت ۱۴ روز روزانه با تزریق داخل توموری وسیله نقلیه، L-BSO، icFSP1 یا icFSP1 + L-BSO تحت درمان قرار گرفتند (شکل تکمیلی 10a). قابل توجه است که درمان با BSO، icFSP1 یا ترکیب آنها منجر به کاهش قابل توجهی در اندازه تومور نشد (شکل 5g و شکل تکمیلی 10c-f). در مقابل، تکدرمانی با viFSP1 به طور قابل توجهی بار تومور داخل غده را کاهش داد (شکل 5g و شکل تکمیلی 10c-f). با این حال، درمان همزمان با BSO و viFSP1 اثر تقویتشدهای در مقایسه با viFSP1 به تنهایی در شرایط درونتنی ایجاد نکرد، با وجود اینکه درمان ترکیبی در شرایط آزمایشگاهی کارایی بیشتری نشان داده بود. این نتایج بیشتر بر تفاوتهای وابسته به زمینه در قابلیت هدفگیری FSP1 تأکید میکند، بنابراین اهمیت ارزیابی اثرات مهارکنندههای FSP1 را هم در شرایط آزمایشگاهی و هم در شرایط درونتنی برجسته میسازد.
برای تأیید بیشتر ویژگی و پتانسیل درمانی مهار FSP1 در شرایط درونتنی، ما FSEN1 را آزمایش کردیم، یک مهارکننده FSP1 با ساختار شیمیایی متمایز و ویژه برای انسان۳۶،۴۰. FSEN1 با استفاده از همان فرمولاسیون و رژیم دوزینگ viFSP1 تجویز شد (شکل تکمیلی 10a). قابل توجه است که FSEN1 نیز به طور قابل توجهی رشد تومور داخل غده را کاهش داد (شکل 5h و شکل تکمیلی 10g,h) و بقای کلی را در موشهای NSG افزایش داد (شکل تکمیلی 10i). این یافتهها بیشتر از کارایی درونتنی مهار دارویی FSP1، به ویژه در ریزمحیط غدد لنفاوی، با استفاده از ترکیبات با ساختارهای متمایز، پشتیبانی میکنند.
برای بررسی اثرات جانبی بالقوه، ما از مدلهای سینژنیک با ردههای LN7-1134BL Fsp1 WT و KO که به صورت داخل غده لنفاوی یا زیرجلدی به موشهای C57BL/6J با سیستم ایمنی سالم تزریق شده بودند، استفاده کردیم (شکل تکمیلی 10b). تزریق موضعی روزانه viFSP1 به طور قابل توجهی رشد تومور داخل غده را در تومورهای WT هم در نقطه پایانی آزمایش (و هم در نقاط زمانی منطبق با نقطه پایانی آزمایشهای زیرجلدی) کاهش داد، در حالی که هیچ پاسخی در تومورهای Fsp1-KO مشاهده نشد (شکل 5i و شکل تکمیلی 10j-m)، که تأیید میکند فعالیت viFSP1 بر روی هدف است. تومورهای Fsp1-KO رشد کندتری و در برخی موارد پسرفت نشان دادند، که نشان میدهد حذف ژنتیکی Fsp1 سلولهای مشتق از غدد لنفاوی را در غدد لنفاوی حساس میکند (شکل 5i و شکل تکمیلی 10j-m).
برای ارزیابی اینکه آیا این وابستگی مختص ریزمحیط غدد لنفاوی است، ما رشد تومور زیرجلدی را در همان مدل مقایسه کردیم. در این زمینه، درمان با viFSP1 تنها منجر به کاهش جزئی در رشد تومور در تومورهای WT شد و هیچ تأثیری در تومورهای Fsp1-KO نداشت (شکل 5i و شکل تکمیلی 10n-q). در واقع، هیچ کاهشی در رشد تومور در تومورهای Fsp1-KO که با viFSP1 تیمار شده بودند یا نشده بودند، مشاهده نشد (شکل 5i و شکل تکمیلی 10n-q). این یافتهها نشان میدهند که وابستگی به FSP1 در محیط غدد لنفاوی به طور قابل توجهی نسبت به تومورهای زیرجلدی افزایش مییابد.
با توجه به اهمیت FSP1 در تومورهای غدد لنفاوی، ما سهم FSP1 را در استقرار متاستاتیک ارزیابی کردیم. متاستاز تجربی از طریق تزریق وریدی سلولهای LN7 Fsp1-WT یا -KO منجر به افزایش جزئی در استقرار در ریه در موشهای تزریق شده با ردههای Fsp1-KO شد (شکل تکمیلی 10r)، که نشان میدهد از دست دادن FSP1 بقای کلی سلولهای ملانومای متاستاتیک در جریان خون را کاهش نمیدهد. با این حال، در مدلهای خودبهخودی متاستاز، اگرچه هیچ تفاوتی در رشد تومور اولیه موشهایی که به صورت زیرجلدی با سلولهای LN7 Fsp1-WT یا -KO کاشته شده بودند، وجود نداشت (شکل تکمیلی 10s؛ مطابق با شکل 5i)، موشهای دارای تومورهای LN7 Fsp1-KO در مقایسه با تومورهای WT، کاهش قابل توجهی در بروز متاستاز به غدد لنفاوی تخلیهکننده تومور داشتند (شکل تکمیلی 10t,u). این یافتهها نشان میدهند که سلولهای ملانوما در غدد لنفاوی زمینهای را ارائه میدهند که در آن هدف قرار دادن FSP1 پتانسیل محدود کردن پیشرفت متاستاتیک را دارد.
بحث
در اینجا ما یک آسیبپذیری سلولهای ملانومای متاستاتیک به غدد لنفاوی را در برابر مهار دارویی FSP1 به عنوان یک تکدرمانی در شرایط درونتنی شناسایی میکنیم. در ردههای متاستاتیک غدد لنفاوی، ما نشان میدهیم که GCLC و GSH کاهش مییابند (شکلهای ۱ و ۲) و GPX4 تحت تخریب وابسته به اکسیژن با واسطه یوبیکوئیتین-پروتئازوم قرار میگیرد (شکل ۳). ما نشان میدهیم که رها شدن وابستگی سلولهای ملانوما به محور نظارتی GPX4 در غدد لنفاوی منجر به افزایش وابستگی عملکردی به FSP1 میشود که دست نخورده باقی میماند و از طریق N-میریستویلاسیون با لیزوزومهای اطراف هستهای تجمع مییابد (شکل ۴).
قابل توجه است که مهار FSP1 برای کاهش بقای ردههای غدد لنفاوی در شرایط آزمایشگاهی کافی نیست (شکل ۵). در مقابل، هم مهار دارویی و هم حذف ژنتیکی FSP1 به طور قابل توجهی رشد ملانوما را در غدد لنفاوی مختل میکند، اما در محلهای زیرجلدی اینطور نیست (شکل ۵)، که بر وابستگیهای سلولهای سرطانی به FSP1 که در شرایط درونتنی به وجود میآیند، تأکید میکند. مطابق با این یافته، یک مطالعه مکمل نشان میدهد که مهار FSP1 در شرایط درونتنی، اما نه در شرایط آزمایشگاهی، به طور قابل توجهی بقای سرطان ریه را کاهش میدهد، که بیشتر نشاندهنده تفاوت وابستگی به مهار FSP1 بین زمینههای درونتنی و آزمایشگاهی است۴۱.
یافتههای ما یک سازگاری متمایز و پایدار را که در طول استقرار در غدد لنفاوی به وجود میآید، شناسایی میکنند: تغییر از وابستگی به GPX4 به وابستگی به FSP1. میزان تأثیر ناهمگونی داخل توموری بر این تغییر در وابستگی به FSP1 هنوز باید مشخص شود. محدودیتهای دیگر این کار شامل درک این موضوع است که چرا مهارکنندههای مولکول کوچک FSP1 در شرایط درونتنی کارایی بیشتری نسبت به شرایط آزمایشگاهی دارند. یک احتمال این است که دسترسی کم به اکسیژن، سطوح بالای اسید اولئیک در محیط لنفاوی و/یا سطوح پایینتر GSH در سلولهای متاستاتیک غدد لنفاوی، وابستگی به FSP1 را فراتر از آنچه در شرایط آزمایشگاهی قابل دستیابی است، افزایش میدهد. احتمال دیگر این است که محیط درونتنی فارماکوکینتیک مطلوبی را برای مهارکنندههای مولکول کوچک FSP1 فراهم میکند. تفاوت کارایی بین icFSP1 و viFSP1/FSEN1 ممکن است منعکسکننده مکانیسمهای عملکردی مجزا این مولکولهای کوچک در شرایط درونتنی باشد که میتواند تفاوتها در کارایی را توضیح دهد؛ این موضوع همچنان یک حوزه تحقیقاتی فعال است. علاوه بر این، ارتباط FSP1 با لیزوزومها سوالات متعدد و هنوز بررسینشدهای را در مورد مکانیسمهای زیربنایی این مکان، از جمله چگونگی محافظت FSP1 از لیزوزومها در برابر اکسیداسیون لیپید، مطرح میکند.
یافتههای ما نشان میدهد که زمینههایی وجود دارند که نویدبخش هدفگیری FSP1 در شرایطی هستند که GPX4 به طور درونزا کاهش بیان دارد. علاوه بر این، یافتههای ما فرصت قابل توجهی برای درک و هدفگیری درمانی وابستگی به زمینه فیزیولوژیکی ظریف فروپتوز۴۲ فراهم میکنند، که پیامدهایی برای حالات بیماری پاتوفیزیولوژیکی فراتر از حوزه سرطان، مانند تخریب عصبی و آسیب ایسکمی-خونرسانی مجدد که با آسیبپذیریهای افزایشیافته فروپتوز مشخص میشوند، دارد۱. تنظیم فعالیت FSP1 و تغییرات در توزیع زیرسلولی FSP1 به عنوان اهداف امیدوارکنندهای برای حساس کردن سلولهای ملانوما در غدد لنفاوی به فروپتوز و در نتیجه کاهش پیشرفت سرطان، پدیدار میشوند.
روشها
ردههای سلولی
B16-F0 (ATCC؛ CRL-6322) و مشتقات متاستاتیک غدد لنفاوی آن: NBF0-LN1-18IL، NBF0-LN7-1112AR، NBF0-LN7-1120BL، NBF0-LN7-1134BL، NBF0-LN8-1194BR، NBF0-LN8-1198AR، NBF0-LN8-1205BL، NBF0-LN9-1315BL و NBF0-LN9-1358IR – توسط آزمایشگاه Reticker-Flynn تهیه شدند. برای سادگی، این ردههای سلولی در سراسر مقاله به ترتیب به صورت: B16-F0، LN1-18IL، LN7-1112AR، LN7-1120BL، LN7-1134BL، LN8-1194BR، LN8-1198AR، LN8-1205BL، LN9-1315BL و LN9-1358IR نامیده میشوند. سلولهای B16F10 نوع وحشی (WT)، B16F10 Fsp1-KO و B16F10 Gpx4-KO از آزمایشگاه Conrad تهیه شدند. ردههای B16-F0 Fsp1-KO، LN7-1134BL Fsp1-KO، LN9-1315BL Fsp1-KO، B16-F0 Gclc-overexpression، LN7-1134BL Gclc-overexpression، B16-F0 Gclc-KO و B16-F0 Nrf2-overexpression در این مطالعه تولید شدند. ردههای سلولی ملانومای انسانی MeWo، SK-MEL-5، A375، ردههای ملانومای موشی Yale University Melanoma Model (YUMM) 3.3 و YUMM 5.2، و سلولهای HEK293T از ATCC خریداری شدند. تمام ردههای سلولی در محیط Eagle’s Medium اصلاحشده Dulbecco (DMEM؛ Thermo Fisher Scientific، 11885076) با ۱۰٪ FBS (Thermo Fisher Scientific، 26400044) و ۱٪ پنیسیلین-استرپتومایسین (Thermo Fisher Scientific، 15140122) کشت داده شدند. تمام ردههای دیگر توسط ATCC با استفاده از پروفایلسازی STR تأیید هویت شدند. سلولها به طور معمول برای آلودگی مایکوپلاسما با استفاده از MycoStrip (InvivoGen، rep-mys-50) آزمایش میشدند.
مواد شیمیایی
RSL3 (HY-100218A)، erastin-2 (HY-139087)، iFSP1 (HY-136057)، BTZ (HY-10227) و PEG300 (HY-Y0873) از MedChemExpress خریداری شدند. ML-210 (S0788)، MG-132 (S2619) و icFSP1 (E1535) از Selleck Chemicals تهیه شدند. Rotenone (R8875)، oligomycin (75351)، antimycin A (A8674)، L-BSO (B2515)، N-acetyl cysteine (A9165)، Na2SeO3 (S5261)، CQ (C6628) و PEG400 (202398) از Sigma-Aldrich تهیه شدند. FCCP (15218)، MTT (21795)، GSHee (14953)، liproxstatin-1 (17730)، IMP-1088 (25366)، NSC 624206 (20569)، FSEN1 (38025)، viFSP1 (39927) و triacsin C (10007448) از Cayman Chemical Company تهیه شدند. MitoView Fix 640 (70082) و LipidSpot 488 (70065) از Biotium تهیه شدند. Lipofectamine 3000 (L3000015)، Bodipy 581/591 C11 (D3861)، SYTOX Green (S7020)، Lysotracker Deep Red (L12492) و NucBlue Live ReadyProbes Reagent (R37605) از Thermo Fisher Scientific بودند.
پلاسمیدها
پلاسمید
